Development of chitosan based microencapsulated spray dried powder of tuna fish oil: oil load impact and oxidative stability

Abstract The impact of fish oil concentration on the oxidative stability of microcapsules through the spray drying process using chitosan and maltodextrin as wall material was studied. Emulsions were prepared with different Tuna fish oil (TFO) content (TFO-10%, TFO20%, TF030% TF0-40%) while wall material concentration was kept constant. Microencapsulated powder resulting from emulsion prepared with high fish oil load have high moisture content, wettability, total oil and low encapsulation efficiency, hygroscopicity and bulk tapped density. Oxidative stability was evaluated periodically by placing microcapsules at room temperature. Microcapsules prepared with TFO-10% presented high oxidative stability in terms of peroxide value (2.94±0.04) and anisidine value (1.54±0.02) after 30 days of storage. It was concluded that optimal amounts of fish oil for microencapsulation are 10% and 20% using chitosan and maltodextrin that extended its shelf life during study period.

Resumo Foi estudado o impacto da concentração de óleo de peixe na estabilidade oxidativa de microcápsulas por meio do processo de secagem por atomização, utilizando quitosana e maltodextrina como material de parede. As emulsões foram preparadas com diferentes teores de óleo de atum (TFO) (TFO-10%, TFO20%, TF030% TF0-40%), enquanto a concentração de material de parede foi mantida constante. O pó microencapsulado resultante da emulsão preparada com alta carga de óleo de peixe tem alto teor de umidade, molhabilidade e óleo total e baixa eficiência de encapsulação, higroscopicidade e densidade extraída a granel. A estabilidade oxidativa foi avaliada periodicamente colocando microcápsulas à temperatura ambiente. As microcápsulas preparadas com TFO-10% apresentaram alta estabilidade oxidativa em termos de valor de peróxido (2,94 ± 0,04) e valor de anisidina (1,54 ± 0,02) após 30 dias de armazenamento. Concluiu-se que as quantidades ideais de óleo de peixe para microencapsulação são de 10% e 20% usando quitosana e maltodextrina que prolongaram sua vida útil durante o período de estudo.

Development of chitosan based microencapsulated spray dried powder of tuna fish oil: oil load impact and oxidative stability / Desenvolvimento de pó microencapsulado por pulverização de óleo de atum à base de quitosana: impacto da carga de óleo e estabilidade oxidativa

Abstract The impact of fish oil concentration on the oxidative stability of microcapsules through the spray drying process using chitosan and maltodextrin as wall material was studied. Emulsions were prepared with different Tuna fish oil (TFO) content (TFO-10%, TFO20%, TF030% TF0-40%) while wall material concentration was kept constant. Microencapsulated powder resulting from emulsion prepared with high fish oil load have high moisture content, wettability, total oil and low encapsulation efficiency, hygroscopicity and bulk tapped density. Oxidative stability was evaluated periodically by placing microcapsules at room temperature. Microcapsules prepared with TFO-10% presented high oxidative stability in terms of peroxide value (2.94±0.04) and anisidine value (1.54±0.02) after 30 days of storage. It was concluded that optimal amounts of fish oil for microencapsulation are 10% and 20% using chitosan and maltodextrin that extended its shelf life during study period.

Resumo Foi estudado o impacto da concentração de óleo de peixe na estabilidade oxidativa de microcápsulas por meio do processo de secagem por atomização, utilizando quitosana e maltodextrina como material de parede. As emulsões foram preparadas com diferentes teores de óleo de atum (TFO) (TFO-10%, TFO20%, TF030% TF0-40%), enquanto a concentração de material de parede foi mantida constante. O pó microencapsulado resultante da emulsão preparada com alta carga de óleo de peixe tem alto teor de umidade, molhabilidade e óleo total e baixa eficiência de encapsulação, higroscopicidade e densidade extraída a granel. A estabilidade oxidativa foi avaliada periodicamente colocando microcápsulas à temperatura ambiente. As microcápsulas preparadas com TFO-10% apresentaram alta estabilidade oxidativa em termos de valor de peróxido (2,94 ± 0,04) e valor de anisidina (1,54 ± 0,02) após 30 dias de armazenamento. Concluiu-se que as quantidades ideais de óleo de peixe para microencapsulação são de 10% e 20% usando quitosana e maltodextrina que prolongaram sua vida útil durante o período de estudo.

Complexos polieletrólitos de quitosana e xantana carregados com ativos naturais e sintéticos: estudo físico/químico e microbiológico para aplicação de drug delivery / Polyelectrolyte complexes of chitosan and xanthan loaded with natural and synthetic actives: physicochemical and microbiological study for drug delivery application

A eficácia dos implantes osseointegrados é amplamente reconhecida na literatura científica. Contudo, infiltrações bacterianas na junção implante-pilar podem desencadear inflamação nos tecidos circundantes, contribuindo para a evolução de condições mais sérias, como a peri-implantite. O objetivo desse estudo foi produzir complexos polieletrólitos (PECs) de quitosana (Q) e xantana (X) em forma de membranas, carregá-las com ativos naturais e sintéticos antimicrobianos, caracterizálas estruturalmente e avaliá-las frente a degradação enzimática, cinética de liberação e ações antimicrobianas com finalidade de aplicação para drug delivery. Membranas de QX a 1% (m/v) foram produzidas em três proporções, totalizando doze grupos experimentais: QX (1:1); QX (1:2), QX (2:1), QX-P (com própolis) (1:1); QX-P (1:2); QX-P (2:1); QX-C (com canela) (1:1); QX-C (1:2); QX-C (2:1) e CLX (com clorexidina 0,2%) (1:1); CLX (1:2); CLX (2:1). Para os estudos de caracterização foram feitas análises da espessura em estado seco; análises morfológicas superficial e transversal em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); análise estrutural de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR); análise de degradação por perda de massa sob ação da enzima lisozima; e análise da cinética de liberação dos ativos em saliva artificial. Para os testes microbiológicos, análises de verificação de halo de inibição e ação antibiofilme foram feitas contra cepas de Staphylococcus aureus (S. aureus) e Escherichia coli (E. coli). Os resultados demonstraram que a espessura das membranas variou conforme a proporção, sendo que o grupo QX (1:2) apresentou a maior média de 1,022 mm ± 0,2, seguida respectivamente do QX (1:1) com 0,641 mm ± 0,1 e QX (2:1) com 0,249 mm ± 0,1. Nas imagens de MEV é possível observar uma maior presença de fibras, rugosidade e porosidade nos grupos QX (1:2) e QX (1:1) respectivamente, e, no QX (2:1) uma superfície mais lisa, uniforme e fina. No FTIR foram confirmados os picos característicos dos materiais isoladamente, além de observar as ligações iônicas que ocorreram para formação dos PECs. Na análise de degradação, os grupos com ativos naturais adicionados tiveram melhores taxas de sobrevida do que os grupos QX. No teste de liberação, os grupos QX-P tiveram uma cinética mais lenta que os QX-C, cuja liberação acumulada de 100% foi feita em 24 h. Já nos testes do halo inibitório, somente os grupos CLX tiveram ação sobre as duas cepas, e os QX-P tiveram sobre S. aureus. Nas análises antibiofilme, os grupos CLX apresentaram as maiores taxas de redução metabólica nas duas cepas (± 79%); os grupos QX-P apresentaram taxas de redução similares em ambas as cepas, porém com percentual um pouco maior para E. coli (60- 80%) e os grupos QX-C tiveram grande discrepância entre as duas cepas: de 35 a 70% para S. aureus e 14 a 19% para E. coli. Pode-se concluir que, frente as análises feitas, o comportamento do material foi afetado diretamente pelos ativos adicionados a matriz polimérica. As proporções de Q ou X afetaram somente a espessura final. Quanto a aplicação proposta de drug delivery, os dispositivos apresentaram grande potencial, principalmente os grupos CLX e QX-P. (AU)

The effectiveness of osseointegrated implants is widely recognized in scientific literature. However, bacterial infiltrations at the implant-abutment interface may trigger inflammation in surrounding tissues, contributing to the development of more serious conditions, such as peri-implantitis. The aim of this study was to produce chitosan (Q) and xanthan (X) polyelectrolyte complexes (PECs) in the form of membranes, load and evaluate them for enzymatic degradation, release kinetics, and antimicrobial actions for drug delivery applications. QX membranes at 1% (w/v) were produced in three proportions, totaling twelve experimental groups: QX (1:1), QX (1:2), QX (2:1), QX-P (with propolis) (1:1), QX-P (1:2), QX-P (2:1), QX-C (with cinnamon) (1:1), QX-C (1:2), QX-C (2:1), and CLX (with 0.2% chlorhexidine) (1:1), CLX (1:2), CLX (2:1). Characterization studies included analyses of dry state thickness, surface and crosssectional morphology using Scanning Electron Microscopy (SEM), structural analysis by Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy, mass loss degradation analysis under lysozyme action, and active release kinetics analysis in artificial saliva. Microbiological tests included verification analyses of inhibition halos and antibiofilm action against strains of Staphylococcus aureus (S. aureus) and Escherichia coli (E. coli). Results showed that membrane thickness varied according to proportion, with group QX (1:2) presenting the highest average of 1.022 mm ± 0.2, followed by QX (1:1) with 0.641 mm ± 0.1, and QX (2:1) with 0.249 mm ± 0.1. SEM images showed greater presence of fibers, roughness, and porosity in groups QX (1:2) and QX (1:1) respectively, while QX (2:1) exhibited a smoother, more uniform, and thinner surface. FTIR confirmed characteristic peaks of the materials individually, besides showing ionic bonds formed for PECs. Degradation analysis revealed that groups with added natural actives had better survival rates than QX groups. In release tests, QX-P groups exhibited slower kinetics than QX-C, with 100% cumulative release achieved in 24 h. inhibitory halo tests, only CLX groups exhibited action against both strains, while QX-P acted against S. aureus. Antibiofilm analyses showed CLX groups with the highest metabolic reduction rates in both strains (± 79%); QX-P groups showed similar reduction rates in both strains, slightly higher for E. coli (60-80%), and QX-C groups had a significant discrepancy between strains: 35-70% for S. aureus and 14-19% for E. coli. In conclusion, material behavior was directly affected by added actives to the polymeric matrix. Proportions of Q or X only affected final thickness. Regarding proposed drug delivery applications, the devices showed great potential, especially CLX and QX-P groups.(AU)

Novo sistema de liberação de drogas ­ filme de fibroína de seda carregado ou não com insulina para reparo de feridas em mucosa palatina: estudo in vitro e clínico randomizado / A new drug delivery system ­ silk fibroin film loaded or not with insulin on palatal mucosa wound healing: in vitro study and a randomized clinical trial

Several types of periodontal and peri-implant soft tissue defects require surgical treatment to reestablish function and aesthetics. However, local, and systemic factors can jeopardize tissue repair leading to unexpected outcomes and postoperative discomfort. In order to overcome this problem, new devices have been developed to improve surgical procedures outcomes and patient experience. The aim of the present study was to develop a new silk fibroin (SF)/chitosan (CH) film loaded with insulin as a drug delivery system to improve palatal donor area healing after free gingival graft harvesting for ridge preservation. For this, biomaterial development, characterization and in vitro assessment were performed to evaluate the new delivery system. In addition, 3- months outcomes from palatal wound healing following the use of the proposed delivery system were assessed through clinical, patient centered parameters, immunological, microbiological, and histological evaluations. Sixty-nine patients with indication of tooth extraction were enrolled into 3 groups: Control Group (C) (n=23): open wound on palatal mucosa followed by spontaneous healing; SF/CH Film (F) (n=23): open wound on palatal mucosa and silk fibroin film as dressing; Insulin-loaded SF/CH film (IF) (n=23): open wound on palatal mucosa and an insulin- loaded silk fibroin film as a delivery system. : It was verified some characteristics that are favorable to the oral environment, such as mechanical properties, swelling and permeability to water vapor. The biomaterial presented a standard of a controlled release system through diffusion with delivery stability in human saliva, along with an excellent biocompatibility with the absence of cytotoxicity and genotoxicity increasing cell viability in lineage cells (HaCat). F and IF promoted accelerated palatal wound closure on day 7 and 14 after surgery, as well as an early epithelialization, compared to the C group. Both films were capable to reduce pro-inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IL-1ß) and modulate biomarkers correlated to tissue degradation/remodeling. Spontaneous healing microbiome reported higher genus/species with pathogenic role in the oral mucosa with reduction in health species following this profile until de end of the follow-up. A tendency of eubiosis was observed in F and IF groups throughout healing process. It seems that this new device has a promising application in oral cavity and positively influence wound healing. (AU)

Diversos tipos de defeitos mucogengivais requerem abordagem cirúrgica para o reestabelecimento funcional e estético. Porém, alterações locais e sistêmicas podem prejudicar o processo de reparo gerando resultados inesperados e desconforto ao paciente. Biomateriais vem sendo desenvolvidos para melhorar os resultados dos procedimentos cirúrgicos e a experiência clínica do paciente. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um filme de fibroína de seda (FS) e quitosana (QT) carregado com insulina (INS), atuando como um sistema de liberação, para acelerar a cicatrização de feridas na área doadora palatina após procedimento de preservação de rebordo com uso de enxerto gengival livre. Para isso, foi executado o desenvolvimento, caracterização e avaliação in vitro do biomaterial. Ademais, o resultado de 3 meses do reparo das feridas palatinas foi verificado por meio de avaliações clínicas, imunológica, microbiológica, histológica, bem como parâmetros centrados no paciente. Sessenta e nove pacientes foram alocados aleatoriamente nos grupos Controle (C) (n=23): ferida aberta em palato seguido de cicatrização espontânea; Filme de FS/QT (F) (n=23): ferida aberta em palato associada ao filme na área doadora; Filme de FS/QT carregado com INS (IF) (n=23): ferida aberta em palato associada ao filme carregado com INS na área doadora. Verificou-se propriedades mecânicas, bem como de entumecimento e permeabilidade ao vapor de água, favoráveis ao meio bucal sem nenhuma alteração com a inclusão da INS. O dispositivo apresentou liberação controlada por meio de difusão com estabilidade em saliva humana. Excelente biocompatibilidade com ausência de cito e genotoxicidade foi observada em diversos tipos celulares aumentando a viabilidade celular em células de linhagem (HaCat). F e IF favoreceram um fechamento acelerado da ferida palatina aos 7 e 14 dias pós-injuria, assim como uma epitelização precoce destes comparado ao grupo C. F e IF reduziram citocinas pró-inflamatórias (IL6, TNF-α, IL-1ß) além de apresentarem função modulatória na quantificação de biomarcadores relacionados a degradação tecidual. O Grupo C apresentou gênero/espécies com potencial patogênico e redução de microrganismos relacionados a saúde mantendo este perfil aos 14 e 30 dias. Enquanto isso, uma tendência a eubiose foi observado em F e IF ao longo do processo de cicatrização. Deste modo, verifica-se a aplicação promissora do novo dispositivo na cavidade oral bem como capacidade de influenciar positivamente o reparo da mucosa oral. (AU)

Bonding strategy of a universal adhesive system containing chitosan: influence on dentin permeability, and effect on adhesive layer micromorphology / Estratégia de união de um sistema adesivo universal contendo quitosana: influência na permeabilidade dentinária e efeito na micromorfologia da camada do adesivo

ABSTRACT Aim: This study evaluated the influence of chitosan added to a universal adhesive system used in totaletch (TE) or self-etch (SE) mode on dentin permeability, and on the micromorphology of the adhesive layer. Materials and Method: Dentin discs were obtained from human third molars and randomly distributed according to bonding strategy (TE or SE), and to whether or not 1% chitosan (C) was added to a universal adhesive system (Single Bond Universal/3M ESPE), to create the following groups (n=10): TE, TEC, SE, and SEC. Dentin permeability was measured at baseline and after application of dentin treatments. The surface of the adhesive layer (AL) and the dentin adjacent to the AL were examined under a scanning electron microscope. Results: There were no significant differences in permeability percentage between the groups with and without C (TE and SE versus TEC and SEC) (p>0.05; Mann Whitney test). Dentin permeability was lower when the adhesive system was applied in the SE mode, regardless of the addition of C. The micromorphology of the AL surface showed irregularities, and a greater degree of porosity, when the adhesive system was applied in the SE mode, regardless of chitosan addition. There was a greater depth of penetration of the adhesives into the dentin adjacent to the AL in both the TE and TEC groups. Chitosan added to the adhesive system did not influence dentin permeability. Conclusions: The self-etch strategy led to lower dentin permeability, and to more irregularities on the surface of the adhesive layer.

RESUMO Objetivo: Este estudo avaliou a influência da quitosana adicionada a um sistema adesivo universal usado no modo total-etch (TE) ou self-etch (SE) na permeabilidade dentinária e na micromorfologia da camada adesiva. Materiais e método: Discos de dentina foram obtidos de terceiros molares humanos e distribuídos aleatoriamente de acordo com a estratégia de união (TE ou SE), e para incorporação ou não de quitosana a 1% (Q) em um sistema adesivo universal (Single Bond Universal/3M ESPE), para obter os seguintes grupos (n=10): TE, TEQ, SE e SEQ. A permeabilidade da dentina foi medida no início e após a aplicação dos tratamentos de dentina. A superfície da camada adesiva (CA) e a dentina adjacente à CA foram examinadas em microscópio eletrônico de varredura. Resultados: Não houve diferenças significativas no percentual de permeabilidade entre os grupos com e sem Q (TE e SE versus TEQ e SEQ) (p>0,05; teste de Mann Whitney). Houve um menor percentual de permeabilidade dentinária quando o sistema adesivo foi aplicado no modo SE, independentemente da incorporação de Q. A micromorfologia da superfície da CA apresentou irregularidades e maior grau de porosidade quando o sistema adesivo foi aplicado no modo SE, independentemente da adição de Q. Houve maior profundidade de penetração dos adesivos na dentina adjacente à CA nos grupos TE e TEQ. A quitosana adicionada ao sistema adesivo não influenciou a permeabilidade dentinária. Conclusões: A estratégia autocondicionante levo

Biocomponents Based on Hydroxiapatite: Influence of Sterilization on the Mechanical Resistance / Biocomponentes à base de hidroxiapatita: Influência da esterilização na resistência mecânica

Abstract Objective This study aimed to evaluate the influence of sterilization on the compressive and flexural mechanical strength of hydroxyapatite-based biocomponents obtained through freeze-dried bovine bone, and its association with chitosan. Methods Freeze-dried bovine bone was processed into 100 μm particles and mixed with 50% of its weight in chitosan. The mixture was packed in metallic molds for preparing the specimens, and sterilized at 127°C using an autoclave for subsequent experimentation. The specimens were subjected to compression and flexion tests following norm 5833 of the International Organization for Standardization (ISO), with 6 × 12 mm cylindrical blocks (for compression tests) and 75 × 10 × 3.3 mm plates (for flexion tests) as samples. The samples were divided into four groups of 20 specimens each, with 10 for compression and 10 for flexion tests. Three groups were sterilized (autoclave, gamma rays, and ethylene oxide), whereas the fourth group (control) was not. The mechanical tests obtained from the different sterilization processes were compared using analysis of variance (ANOVA, p< 0.05), followed by the Tukey multiple comparison test of means, with a 95% confidence interval. Results The specimens presented mean compressive strengths of 10.25 MPa for the control group and 3.67 MPa, 9.65 MPa, and 9.16 MPa after ethylene oxide, gamma ray, and autoclave sterilization, respectively. Flexion test results showed an average resistance of 0.40 MPa in the control group, and 0.15 MPa, 0.17 MPa, and 0.30 MPa after ethylene oxide, gamma ray, and autoclave sterilization, respectively. There were statistically significant differences observed in the maximum compression of the ethylene oxide-sterilized group compared with that of the control group (p= 0.0002), gamma ray-sterilized (p= 0.0003), and the autoclaved (p= 0.0006) groups. There was a statistically significant difference in maximum flexion of the specimens sterilized by gamma rays when compared with the control group (p= 0.0245). However, low flexural strengths were observed in all specimens. Conclusion The autoclave sterilization group did not result in statistically significant differences in either compression or flexion strength tests. Thus, the autoclave proved to be the best sterilization option for the hydroxyapatite-based biocomponents in this study.

Resumo Objetivo O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da esterilização na resistência mecânica à compressão e flexão de biocomponentes à base de hidroxiapatita obtida a partir de osso bovino liofilizado e sua associação com quitosana. Métodos O osso bovino liofilizado foi processado em partículas de 100 μm e misturado à quitosana em proporção de 50% de seu peso. A mistura foi acondicionada em moldes metálicos para preparo dos espécimes e esterilizada a 127°C em autoclave para posterior experimentação. Os espécimes foram submetidos a ensaios de compressão e flexão seguindo a norma 5833 da International Organization for Standardization (ISO); os espécimes eram blocos cilíndricos de 6 × 12 mm (para ensaios de compressão) e placas de 75 × 10 × 3,3 mm (para ensaios de flexão). As amostras foram divididas em quatro grupos de 20 espécimes cada, sendo 10 para ensaios de compressão e 10 para ensaios de flexão. Três grupos foram esterilizados (por autoclavagem, raios gama e óxido de etileno), enquanto o quarto grupo (controle) não foi. Os testes mecânicos obtidos nos diferentes processos de esterilização foram comparados por análise de variância (ANOVA, p< 0,05) seguido pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey, com intervalo de confiança de 95%. Resultados Os espécimes apresentaram resistências médias à compressão de 10,25 MPa para o grupo de controle e 3,67 MPa, 9,65 MPa e 9,16 MPa após esterilização com óxido de etileno, raios gama e autoclavagem, respectivamente. Os resultados do teste de flexão mostraram uma resistência média de 0,40 MPa no grupo de controle, e 0,15 MPa, 0,17 MPa e 0,30 MPa após esterilização com óxido de etileno, raios gama e autoclavagem, respectivamente. A compressão máxima observada no grupo esterilizado com óxido de etileno foi estatisticamente diferente à obtida no grupo de controle (p= 0,0002), esterilizado com raios gama (p= 0,0003) e autoclavado (p= 0,0006). A flexão máxima dos espécimes esterilizados com raios gama foi estatisticamente diferente à observada no grupo de controle (p= 0,0245). No entanto, a resistência à flexão foi baixa em todos os espécimes. Conclusão A esterilização em autoclave não foi associada a diferenças estatisticamente significativas nos testes de compressão ou flexão. Assim, a autoclave foi a melhor opção de esterilização para os biocomponentes à base de hidroxiapatita neste estudo.

Effect of chitosan treatment on shear bond strength of composite to deep dentin using self-etch and total-etch adhesive systems / Efeito do tratamento com quitosana na resistência ao cisalhamento de resina compost em dentina profunda usando sistemas adesivos autocondicionantes e condicionamento total

Objective: To assess the shear bond strength (SBS) of resin composite to deep dentin, using 1 and 2.5% chitosan pretreatment as well as different adhesive systems. Material and Methods: 80 human maxillary molars were randomly divided to eight groups according to the type of adhesive system and dentin pretreatment (n = 10): I) two-step self-etch system (Clearfil SE bond); II) two-step etch-and-rinse system (Adper single bond 2); III) 2.5% chitosan + Clearfil SE bond; IV) 2.5% chitosan +etch + Adper single bond 2; V) etch + 2.5% chitosan + Adper single bond 2; VI) 1% chitosan + Clearfil SE bond; VII) 1% chitosan + etch + Adper single bond 2; VIII) etch + 1% chitosan + Adper single bond 2 (chitosan solution (w/v): 2.5 g and 1 g of chitosan (Sigma Aldrich, USA) was dissolved in 100 ml of 1% acetic acid). Plastic molds were positioned on dentin and filled with composite (Z350, 3M ESPE, USA). SBS (MPa) was tested using a universal testing machine. ANOVA tests, Tukey's test, and independent t test were used to analyze data (p ≤ 0.05). Results: The highest SBS value among self-etch groups was observed with 1% chitosan (p = 0.001). In the etch-and-rinse group, the SBS of 1% chitosan was significantly lower than the other groups. Chitosan treatment following acid etching led to higher SBS in comparison to when chitosan was applied before etching, with the significant difference in 1% concentration (p = 0.030). A predominance of mix fractures was observed in dentin. Conclusion: Improved dentin bond strength can be achieved through immediate dentin pretreatment with 1% chitosan in self-etch adhesive systems. Chitosan Pretreatment may not be advantageous for etch-and-rinse adhesive systems. (AU)

Objetivo: Avaliar a resistência ao cisalhamento (RC) da resina composta em dentina profunda, utilizando quitosana de 1 e 2,5% como pré-tratamento, e também diferentes sistemas adesivos. Materiai e métodos: 80 molares superiores humanos foram divididos aleatoriamente em oito grupos de acordo com o tipo de sistema adesivo e pré-tratamento dentinário (n = 10): I) sistema autocondicionante de dois passos (Clearfil SE bond); II) sistema convencional de dois passos (Adper Single Bond II); III) quitosana 2,5% + Clearfil SE bond; IV) quitosana 2,5% + ácido + Adper single bond; V) ácido + quitosana 2,5% + Adper single bond II; VI) quitosana 1% + Clearfil SE bond; VII) quitosana 1% + ácido + Adper single bond II; VIII) ácido + quitosana 1% + Adper single bond II (solução de quitosana (w/w): 2,5 ge 1 g de quitosana (Sigma Aldrich, EUA) foi dissolvido em 100 ml de ácido acético a 1%). Moldeiras foram posicionados na dentina e preenchidos com resina composta (Z350, 3M ESPE, EUA). O RC (MPa) foi testado em uma máquina de teste universal. Os testes ANOVA, teste de Tukey e teste t foram usados para analisar os dados (p ≤ 0,05). Resultados: O maior valor de RC entre os grupos autocondicionantes foi observado com quitosana a 1% (p = 0,001). No grupo do condicionamento total a RC da quitosana a 1% foi significativamente menor do que nos outros grupos. O tratamento com quitosana após o condicionamento ácido levou a um maior RC em comparação a quitosana aplicada antes do condicionamento, com diferença significativa na concentração de 1% (P = 0,030). Observou-se predomínio de fraturas na dentina. Conclusão: A resistência de união à dentina pode ser alcançada por meio do pré-tratamento imediato da dentina com quitosana a 1% em sistemas adesivos autocondicionantes. O pré-tratamento com quitosana pode não ser vantajoso para sistemas adesivos de condicionamento total. (AU)

Associação da quitosana à terapia fotodinâmica para controle de Candida albicans: estudo em culturas planctônicas, biofilmes e células persistentes / Association of chitosan and photodynamic therapy to control Candida albicans: study in planktonic cultures, biofilms and persister cells

A terapia fotodinâmica (TFD) vem se mostrando como um método eficaz no controle de micro-organismos patogênicos, sendo investigada para o tratamento de diversas doenças infecciosas, como a candidose bucal. Recentemente, alguns agentes potencializadores dessa terapia têm sido estudados, incluindo a Quitosana (QT), um polímero natural extraído do exoesqueleto de crustáceos. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito potencializador da QT na TFD mediada pelo fotossensibilizador Azul de Metileno (AM) sobre cepas de Candida albicans, investigando sua ação em culturas planctônicas, biofilmes e células persistentes ao fluconazol. Além disso, foi avaliado a capacidade da QT em interferir na absorção do AM pelas células de Candida. Foram utilizadas duas cepas de C. albicans, sendo uma padrão (ATCC 18804) e uma clínica isolada de candidose orofaríngea (70). Para os ensaios em culturas planctônicas, as cepas de C. albicans foram cultivadas em caldo Yeast Nitrogen Base (YNB) por 24 horas. Os biofilmes foram formados por 48 horas no fundo das placas de 96 poços. Para indução de células persistentes, C. albicans foi cultivada com altas concentrações de fluconazol por 48 horas. A seguir, foram realizados os tratamentos com QT a 5 mg/mL (pH de 6,5), AM nas concentrações de 300 ou 600 µM, e irradiação com LED (660 nm) na densidade de energia de 30 J/cm2. Foram incluídos oito grupos experimentais: TFD com AM e QT na presença de Luz (AM+QT+L+), AM e QT sem Luz (AM+QT+L-), QT e Luz (QT+L+), QT sem Luz (QT+L-), TFD com AM e Luz (AM+L+), AM sem Luz (AM+L-), Solução Fisiológica com Luz (F-L+) e apenas Solução Fisiológica (F-L-). Após os tratamentos, foi realizada contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL). Para determinar a absorção do fotossensibilizador pelas células de C. albicans, as células foram lisadas e centrifugadas para leitura da densidade óptica. Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (p<0,05%). Na TFD em culturas planctônicas, o AM (300 µm) reduziu as células de Candida em 1,6 log (UFC/mL), enquanto que a associação AM+QT levou à redução de 4,7 log. Na TFD em biofilmes, ocorreu redução microbiana de 2,9 log para o tratamento com AM (600 µm) e de 5,3 log para AM+QT. Em relação às células persistentes, a redução encontrada foi de 0,8 log para AM e 1,5 log para AM+QT. No teste de absorção, a penetração do AM nas células de Candida (DO 0,02) foi aumentada na presença da QT (DO 0,39). Concluiu-se que a QT potencializou o efeito antimicrobiano da TFD em culturas planctônicas, biofilmes e células persistentes de C. albicans, provavelmente por facilitar a penetração do AM nas células fúngicas.

Photodynamic therapy (PDT) has been shown to be an effective method to control pathogenic microorganisms, being investigated for the treatment of several infectious diseases, such as oral candidiasis. Recently, some agents that enhance this therapy have been studied, including Chitosan (CS), a natural polymer extracted from the exoskeleton of crustaceans. The aim of this study was to evaluate the potentiating effect of CS on Methylene Blue (MB) photosensitizer-mediated PDT on Candida albicans strains, investigating its action on planktonic cultures, biofilms and persister cells to fluconazole. In addition, the ability of CS to interfere with MB absorption by Candida cells was evaluated. Two strains of C. albicans were used, one standard (ATCC 18804) and one isolated clinical of oropharyngeal candidosis (70). For assays in planktonic cultures, C. albicans strains were cultivated in Yeast Nitrogen Base broth (YNB) for 24 hours. Biofilms were formed for 48 hours at the bottom of 96-well plates. For the induction of persister cells, C. albicans was cultivated with high concentrations of fluconazole for 48 hours. Next, treatments were performed with CS at 5 mg/mL (pH 6.5), MB at concentrations of 300 or 600 µM, and irradiation with LED (660 nm) at an energy density of 30 J/cm2. eight experimental groups were included: PDT with MB and CS in the presence of Light (MB+CS+L+), MB and CS without Light (MB+CS+L-), CS and Light (CS+L+), CS without Light (CS +L-), PDT with MB and Light (MB+L+), MB without Light (MB+L-), Physiological Solution with Light (F-L+) and Physiological Solution only (FL-). After the treatments, colony forming units (CFU/mL) were counted. To determine the absorption of the photosensitizer by C. albicans cells, the cells were lysed and centrifuged for optical density reading. Data were analyzed by ANOVA and Tukey test (p<0.05%). In PDT in planktonic cultures, MB (300 µm) reduced Candida cells by 1.6 log (CFU/mL), while the MB+CS association led to a 4.7 log reduction. In PDT in biofilms, there was a microbial reduction of 2.9 log for the treatment with MB (600 µm) and of 5.3 log for MB+CS. Regarding persister cells, the reduction found was 0.8 log for MB and 1.5 log for MB+CS. In the absorption test, the penetration of MB into Candida cells (OD 0.02) was increased in the presence of CS (OD 0.39). It was concluded that CS potentiated the antimicrobial effect of PDT in planktonic cultures, biofilms and persister cells of C. albicans, probably by facilitating the penetration of MB into fungal cells .

Biocompatibilidade do gel de quitosana associado ao glicerol fosfato na reparação de defeitos ósseos induzidos experimentalmente no rádio de coelhos (Oryctolagus cuniculus) / [Biocompatibility of chitosan gel associated with glycerol phosphate for the healing of experimentally induced radial defects in rabbits (Oryctolagus cuniculus)]

A engenharia de tecidos caracteriza-se como ciência interdisciplinar, a qual vem desenvolvendo biomateriais para a regeneração do tecido ósseo no âmbito das medicinas humana e veterinária. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a regeneração óssea obtida da aplicação do hidrogel de quitosana associado ao glicerol fosfato em falha óssea experimentalmente induzida no rádio de coelhos. Foram utilizados 15 coelhos adultos, distribuídos aleatoriamente em dois grupos, representados por cada um dos rádios de cada animal, sendo um grupo tratado com hidrogel de quitosana associado ao glicerol fosfato (grupo biomaterial - GB) e um grupo que não recebeu tratamento com o biomaterial (grupo controle - GC). Os animais foram avaliados radiograficamente, por densitometria óptica e análise histológica, nos períodos 30, 60 e 90 dias pós-operatórios. Houve superioridade estatística na média geral das avaliações radiográficas do GB (2,33±0,48) sobre o GC (1,77±0,06). As médias gerais de avaliação densitométrica do GB foram superiores às do GC, sendo 6,207±1,374 e 5,71±1,512, respectivamente. A avaliação histopatológica do GB foi superior à do GC nos períodos de 30, 60 e 90 dias. Assim, é possível afirmar que o hidrogel de quitosana constitui biomaterial de características desejáveis, promovendo consolidação óssea mais rápida e eficiente, sem causar reações adversas.(AU)

Tissue engineering is an interdisciplinary science that has been developing biomaterials for bone regeneration in medicine and veterinary medicine, following an imminent need. The aim of this study was to evaluate bone regeneration after use of chitosan hydrogel associated with glycerol phosphate in experimentally induced bone gap in the radius of rabbits. Fifteen adult rabbits were randomly distributed in two experimental groups, represented by each radius of every single animal. The animals in the Biomaterial Group (GB) were treated with a glycerol phosphate-associated chitosan hydrogel and in the Control Group (GC) they received no treatment with the biomaterial. The animals were evaluated clinically, radiographically, histologically and by optic densitometry at 30, 60 and 90 days postoperatively. There was statistical superiority in the general average of the radiographic estimates of GB (2.33 ± 0.48) over the CG (1.77 ± 0.06). The general averages of GB densitometric evaluation were higher than the CG, being 6.207 ± 1.374 and 5.71 ± 1.512, respectively. Histopathological evaluation of GB was superior to CG in periods of 30, 60 and 90 days. Chitosan hydrogel constitutes a biomaterial of desired characteristics, promoting faster and more efficient bone repair when compared to GC.(AU)

Antibacterial activity of chitosan biofilm for the conservation of fertile and table eggs / Atividade antibacteriana de biofilme de quitosana para conservação de ovos férteis e de mesa

The aim of this study was to develop a chitosan biofilm against Salmonella enteritidis, for the conservation of fertile and table eggs. Two experiments were performed. Experiment 1: 400 specific pathogen-free table eggs were divided in a completely randomized design into four treatments, five replicates and each replicate with 20 table eggs. Experimental groups were assigned to control and 1, 5 and 10% chitosan treatment. The eggs were immersed in the chitosan solution. They were then exposed to Salmonella enteritidis and stored for 1, 24, 96 and 168h at 4ºC. The eggs were then washed with 10mL of physiological saline solution. Experiment 2: 80 specific pathogen-free fertile eggs were tested, the assays were assigned to control and 1, 5 and 10% chitosan treatment. Each treatment had 20 fertile eggs. The eggs were immersed in the chitosan solution. They were individually weighed and incubated. Egg weight, humidity loss, and hatchability (weight and length of newly hatched chicks) characteristics were assessed. In Experiment 1, comparison between treatments showed differences (P< 0.05) in the total recovered of Salmonella enteritidis on eggshell, with the lower values in 5 y 10% chitosan treatment at 96 y 168h respectively. In Experiment 2, chitosan did not show any effect on the egg weight and chick weight, where the average was 57.44 and 38.23g respectively. The humidity loss and chick length showed differences (P< 0.05), with the lower values in 5 y 10% chitosan treatment. The antibacterial activity of chitosan biofilm provide a practical tool against Salmonella enteritidis in fertile and table eggs because the chitosan did not affect egg weight and chick weight, relevant parameters in the poultry industry.(AU)

O presente estudo teve como objetivo desenvolver um biofilme de quitosana contra Salmonella enteritidis, para conservação de ovos férteis e de mesa. Dois experimentos foram realizados. Experimento 1: 400 ovos de mesa livres de patógenos especificados foram divididos em delineamento inteiramente casualizado em quatro tratamentos, cinco repetições e cada réplica contendo 20 ovos de mesa. Grupos experimentais foram designados para controle e 1, 5 e 10% de tratamento com quitosana. Os ovos foram imersos em solução de quitosana. Em seguida foram expostos a Salmonella enteritidis, e armazenados por 1, 24, 96 e 168h a 4ºC. Após, os ovos foram lavados com 10mL de solução salina fisiológica. Experimento 2: 80 ovos férteis livres de patógenos especificados foram testados. Os ensaios foram atribuídos a controle e 1, 5 e 10% de tratamento com quitosana. Cada tratamento teve 20 ovos férteis. Os ovos foram imersos em solução de quitosana. Em seguida foram individualmente pesados e incubados. Peso dos ovos, perda de umidade e características de eclodibilidade (peso e comprimento dos pintinhos recém-nascidos) foram avaliados. No Experimento 1, a comparação entre tratamentos mostrou diferenças (P< 0,05) na quantidade total recuperada de Salmonella enteritidis na casca, com os menores valores em 5 e 10% de tratamento com quitosana a 96 e 168h respetivamente. No experimento 2, a quitosana não mostrou nenhum efeito no peso do ovo e no peso do pintinho, onde a média foi de 57,44 e 38,23g respetivamente. A perda de umidade e comprimento do pintinho apresentaram diferenças (P< 0,05), com os menores valores em 5 e 10% de tratamento com quitosana. A atividade antibacteriana do biofilme de quitosana, fornece uma ferramenta prática contra Salmonella enteritidis em ovos férteis e de mesa, pois a quitosana não afetou o peso do ovo e peso do pintinho, parâmetros relevantes na indústria avícola.(AU)

Anthelmintic activity of nanoencapsulated carvacryl acetate against gastrointestinal nematodes of sheep and its toxicity in rodents / Atividade anti-helmíntica do acetato de carvacrila nanoencapsulado sobre nematoides gastrintestinais de ovinos e toxicidade em roedores

Abstract The objective of this study was to evaluate the efficacy of carvacryl acetate (CVA) and nanoencapsulated CVA (nCVA) on gastrointestinal nematodes of sheep. The CVA was nanoencapsulated with chitosan/gum arabic and the efficacy of nanoencapsulation (EE), yield, zeta potential, nanoparticle morphology and release kinetics at pH 3 and 8 were analyzed. Acute and subchronic toxicity were evaluated in rodents and reduction of egg counts in the faeces (FECRT) of sheep. The sheep were divided into four groups (n = 10): G1, 250 mg/kg CVA; G2, 250 mg/kg nCVA; G3, polymer matrix and G4: 2.5 mg/kg monepantel. EE and nCVA yield were 65% and 57%, respectively. The morphology of the nanoparticles was spherical, size (810.6±286.7 nm), zeta potential in pH 3.2 (+18.3 mV) and the 50% release of CVA at pHs 3 and 8 occurred at 200 and 10 h, respectively. nCVA showed LD50 of 2,609 mg/kg. CVA, nCVA and monepantel reduced the number of eggs per gram of faeces (epg) by 57.7%, 51.1% and 97.7%, respectively. The epg of sheep treated with CVA and nCVA did not differ from the negative control (P>0.05). Nanoencapsulation reduced the toxicity of CVA; however, nCVA and CVA presented similar results in the FECRT.

Resumo O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do acetato de carvacrila (ACV) e do ACV nanoencapsulado (nACV) sobre nematóides gastrintestinais de ovinos. O ACV foi nanoencapsulado com quitosana/goma arábica e foi analisada a eficácia de nanoencapsulamento (EE), o rendimento, potencial zeta, morfologia das nanopartículas e cinética de liberação em pH 3 e 8. Foram avaliadas as toxicidades aguda e subcrônica em roedores e a redução da contagem de ovos nas fezes (RCOF) de ovinos. Os ovinos foram divididos em quatro grupos (n = 10): G1, 250 mg/kg ACV; G2, 250 mg/kg de nACV; G3, matriz polimérica e G4: 2,5 mg/kg de monepantel. A EE e o rendimento de nACV foram de 65% e 57%, respectivamente. A morfologia das nanopartículas foi esférica, tamanho (810,6±286,7 nm), potencial zeta no pH 3,2 (+18,3 mV) e a liberação de 50% de CVA nos pHs 3 e 8 ocorreu às 200 e 10 h, respectivamente. nACV apresentou DL50 de 2.609 mg/kg. ACV, nACV e o monepantel reduziram a contagem de ovos por grama de fezes (opg) em 57,7%, 51,1% e 97,7%, respectivamente. A contagem de opg de ovelhas tratadas com ACV e nCVA não diferiu do controle negativo (P>0,05). O nanoencapsulamento reduziu a toxicidade do AVC; no entanto, nACV e ACV apresentaram resultados semelhantes na RCOF.

Síntese e avaliação dos efeitos de um nanocarreador de miconazol sobre microrganismos orais / Synthesis and evaluation of the effects of a miconazole nanocarrier on oral microorganisms

A presente tese teve como objetivo geral preparar, caracterizar e avaliar os efeitos antimicrobianos de um nanocarreador de miconazol (MCZ) à base de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (NPsMOF) funcionalizadas com quitosana (QS). Assim, dois subprojetos (SP1 e SP2) foram desenvolvidos e apresentaram os seguintes objetivos específicos: SP1) Preparar, caracterizar e avaliar os efeitos do nanocarreador NPsMOF-QS-MCZ sobre células planctônicas e biofilmes simples e misto de Candida albicans e Candida glabrata; SP2) Avaliar o efeito do nanocarreador na composição de três diferentes modelos de biofilmes polimicrobianos patogênicos orais (gengivite, prótese total e cárie dentária). A primeira etapa do SP1 consistiu em revestir as NPsMOF com QS e carregar este core-shell com MCZ, a fim de caracterizar este nanocarreador por métodos físico-químicos. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) do nanocarreador foram determinadas pelo método da microdiluição em caldo, usando o índice da concentração inibitória fracionária a fim de avaliar se houve interação sinergística entre os compostos. Ainda, biofilmes simples e mistos de Candida foram formados no fundo de placas de 24 ou 96 poços por 48 h e, em seguida, tratados por 24 h com NPsMOF-QS-MCZ carreando MCZ a 31,2 e 78 µg/ml, na presença e ausência de um campo magnético externo. Os biofilmes foram avaliados quantitativamente por biomassa total, atividade metabólica, contagem de unidades formadoras de colônias (UFCs) e composição da matriz extracelular. Os dados foram analisados por ANOVA a dois fatores, seguida pelo teste de Holm-Sidak (p<0,05). Ainda, a estrutura dos biofilmes foi avaliada qualitativamente por microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal. Os resultados do SP1 mostraram que o nanocarreador apresentou diâmetro menor que 50 nm e valores de CIM menores do que aqueles encontrados para MCZ sozinho, com efeito sinérgico sobre C. albicans. NPsMOF-QS-MCZ a 78 µg/ml foi mais eficaz que MCZ sozinho na redução de UFCs e atividade metabólica de biofilmes misto e simples de C. albicans. A biomassa total dos biofilmes e a matriz extracelular não foram afetadas pelo nanocarreador, e a aplicação de um campo magnético externo não melhorou seu efeito antibiofilme. As imagens de microscopia confirmam que tratamentos com o nanocarreador, principalmente na maior concentração, apresentaram maior atividade antibiofilme. Com relação ao SP2, as CIMs de NPsMOF-QS-MCZ foram determinadas para diferentes espécies microbianas, e todos os biofilmes polimicrobianos foram desenvolvidos por 5 dias e tratados por 24 h com NPsMOF-QS-MCZ a 64 µg/ml. Após o tratamento, os biofilmes foram avaliados quanto à biomassa total, atividade metabólica, contagem de UFCs e análise composicional por PCR quantitativo. Microscopia eletrônica de varredura foi usada para analisar a estrutura do biofilme. As diferenças entre os grupos foram determinadas por teste t não pareado (p<0,05). Os resultados do SP2 mostraram que NPsMOF-QS-MCZ foi mais eficaz que MCZ sozinho contra a maioria das células fúngicas e bacterianas testadas. Ainda, este nanocarreador foi capaz de reduzir a atividade metabólica, biomassa total e UFCs (p<0,05) dos biofilmes, além de alterar a sua ultraestrutura. Por fim, NPsMOF-QS-MCZ afetou a composição dos três biofilmes polimicrobianos avaliados, reduzindo principalmente os números de Streptococcus spp. e alterando a prevalência das espécies nos biofilmes. Em suma, os resultados dos SP1 e SP2 permitiram concluir que o nanocarreador melhorou o efeito antimicrobiano do MCZ, dependendo da espécie e parâmetro de biofilme avaliados. O nanocarreador também mostrou potencial para interferir nas interações sinergísticas entre células fúngicas e bacterianas dentro de biofilmes polimicrobianos(AU)

The present thesis aimed to prepare, characterize and evaluate the antimicrobial effects of a miconazole (MCZ) nanocarrier based on iron oxide magnetic nanoparticles (IONPs) functionalized with chitosan (CS). Thus, two subprojects (SP1 and SP2) were developed and had the following specific objectives: SP1) To prepare, characterize and evaluate the effects of the IONPs-CS-MCZ nanocarrier on planktonic cells and singleand dual-species biofilms of Candida albicans and Candida glabrata; SP2) To evaluate the effect of IONPs-CS-MCZ on the composition of three different models of oral pathogenic biofilms (gingivitis, denture and dental caries). The first step of SP1 was to coat IONPs with CS and to load this core-shell association with MCZ, in order to characterize this nanocarrier by physicochemical methods. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the nanocarrier were determined by the microdilution method, using the fractional inhibitory concentration index in order to assess whether there was synergistic interaction between the compounds.. In addition, single- and dual-species biofilms of Candida species were formed at the bottom of 24- or 96-well plates for 48 h and, in sequence, treated for 24 h with IONPs-CS-MCZ carrying MCZ at 31.2 and 78 µg/ml, in both the presence and absence of an external magnetic field. Biofilms were quantitatively evaluated by total biomass, metabolic activity, counting of colony forming units (CFUs) and extracellular matrix components. Data were analyzed by twoway ANOVA, followed by Holm-Sidak test (p <0.05). In addition, the structure of biofilms was qualitatively evaluated by scanning electron microscopy and confocal microscopy. The results from SP1 showed that IONPs-CS-MCZ presented diameter smaller than 50 nm, and MIC values lower than those found for MCZ alone, with synergistic effect on C. albicans. Moreover, 78 µg/ml IONPs-CS-MCZ was more effective than MCZ alone in reducing CFUs and metabolic activity of single biofilms of C. albicans and dual-species biofilms. Total biofilm biomass and extracellular matrix were not affected by the nanocarrier, and the application of an external magnetic field did not improve the nanocarrier effects. Microscopy images confirm that treatments with the nanocarrier, mainly in the highest concentration, exhibited greater antibiofilm activity. Regarding SP2, the MICs of IONPs-CS-MCZ were determined for different microbial species, and all polymicrobial biofilms were developed for 5 days and treated for 24 h with IONPs-CS-MCZ at 64 µg/ml. After treatment, the biofilms were evaluated for total biomass, metabolic activity, counting of CFUs and quantitative PCR analysis. Scanning electron microscopy was used to analyze the biofilm ultrastructure. Differences between groups were determined by unpaired t-test (p<0.05). Results from SP2 showed that IONPs-CS-MCZ was more effective than MCZ alone against most fungal and bacterial cells tested. Moreover, this nanocarrier was able to reduce the metabolic activity, total biomass and CFUs (P<0.05) of the biofilms, besides altering their ultrastructure. Finally, IONPs-CS-MCZ affected the composition of the three evaluated biofilms, mainly reducing the numbers of Streptococcus spp. and changing the prevalence of species in the biofilms. From the results obtained by SP1 and SP2, it was possible to conclude that the nanocarrier improved the antimicrobial effect of MCZ, depending on the species and biofilm parameter evaluated. Nanocarrier also showed potential to interfere in the synergistic interactions among fungal and bacterial cells within polymicrobial biofilms(AU)

Caracterização físico-química e atividade biológica de um cimento dentário à base de quitosana, nanohidroxiapatita, nanopartículas de óxido de zinco para estimulação de células nervosas de Schwann (HS-SCH-2) / Physical-chemical characterization and biological activity of a dental cement based on chitosan, nano-hydroxyapatite, and zinc oxide nanoparticles for Schwann nervous cell stimulation (hs-sch-2)

Os cimentos dentários e ortopédicos são utilizados amplamente em diversas aplicações clínicas. Novos cimentos vêm sendo propostos visando à preservação ou regeneração tecidual. Contudo, pouco se conhece sobre o papel desses biomateriais na regeneração nervosa. As células mais comumente envolvidas na regeneração nervosa são as células de Schwann (SCs) sendo sua principal função o suporte aos axônios através da liberação de fatores de crescimento e isolamento axonal através da formação da bainha de mielina. Como estratégia da presente pesquisa, foi estudado um cimento à base da quitosana com adição de substâncias que podem atuar sinergicamente na resposta celular nervosa, tais como, as nanopartículas (NPs) de hidroxiapatita e o óxido de zinco, visto que têm propriedades bioativas e biocondutoras, além de promoverem a condução de prolongamento axonal. A doxiciclina (Dox) foi acrescida como antimicrobiano, potente inibidora de metaloproteinases (MMPs) e estimuladora da diferenciação celular no processo de regeneração tecidual. Assim, as propriedades físico-químicas e biológicas do cimento de nano-hidroxiapatita, quitosana, óxido de zinco e doxiciclina foram avaliadas, bem como a capacidade de promover um ambiente favorável para as células nervosas periféricas. Os cimentos foram caracterizados físico-químicamente mediante a determinação do pH, tempo de presa e solubilidade, lixiviação de íons cálcio, liberação controlada de doxiciclina, difração de Raios X, Termogravimetria (TG), espectroscopia Raman, molhabibidade, e testes de atividade biológica, para assim também serem avaliados em contato com células nervosas de Schwann (HS-Sch-2). O cimento apresentou pH neutro (7,0), tempo de presa de 5,7 ± 0,22 minutos, solubilidade menor que 3%, lixiviação de cálcio de 8,14 ± 0,71 mg L-1 após 14 dias, estabilidade térmica e a análise espectroscópica ratificou a presença e diferenciação das estruturas químicas dos componentes do cimento coerentemente com as imagens das análises microscópicas. Além disso, o cimento se mostrou hidrofílico, teve efeito hemolítico baixo (17%), obteve alta citocompabilidade celular em fibroblastos ATCC 3T3 (72%) e ação antimicrobiana. O cimento aumentou significativamente o crescimento das células de Schwann, 48,6% a mais do que o grupo controle (p≤0.05), e maior capacidade metabólica na análise mitótica quando em contato com este material (33%). Pode-se concluir que o cimento proposto à base de quitosana contendo hidroxiapatita e óxido de zinco nanoparticulados com adição de doxiciclina obteve efeito bioativo em células de Schwann promovendo, assim, o crescimento e a atividade mitótica celular, sendo então um biomaterial promissor para estudos de remielinização de nervos periféricos e regeneração nervosa in vivo.

Dental and orthopedic cements are used widely in several clinical applications. New cements have been proposed aimed the tissue preservation or regeneration. Nevertheless, nerve regeneration is not well known. The cells most commonly used in nerve regeneration are Schwann cells (SCs) which represent glial cells in the peripheral nervous system, their main function being supporting axons by releasing growth factors and axonal isolation through the formation of the myelin sheath. As a strategy of this research, chitosan-based cement was studied with the addition of substances that can act synergistically in the nervous cell response, such as the hydroxyapatite and zinc oxide nanoparticles (NPs), since they have bioactive and bioconductive properties; in addition to furthermore, they promote the conduction of axonal prolongation. Doxycycline (Dox) was added as an antimicrobial, a potent inhibitor of MMPs, a stimulator of cell differentiation in the tissue regeneration process. Thus, the physical-chemical and biological properties of nanohydroxyapatite, chitosan, zinc oxide and doxycycline cements were evaluated, as well as the ability to promote a favorable environment for peripheral nerve cells. Blocks of cements were characterized physically and chemically by determining pH, setting time and solubility, calcium ions leaching, controlled release of doxycycline, X-ray diffraction, Thermogravimetry (TG), Raman spectroscopy, wetness, and biological activity tests, so they can also be evaluated in contact with Schwann nerve cells (HS-Sch-2). The cement showed neutral pH (7.0), setting time of 5.7 ± 0.22 minutes, solubility less than 3%, calcium leaching of 8.14 ± 0.71 mg L-1 after 14 days, stability thermal and spectroscopic analysis confirmed the presence and differentiation of the chemical structures of the cement components coherently with the images of the microscopic analysis. In addition, the cement was shown to be hydrophilic, had a low hemolytic effect (17%), and obtained high cell cytocompatibility in ATCC 3T3 fibroblasts (72%) and antimicrobial action. The cement significantly increased the growth of Schwann cells, 48.6% more than the control group (p≤0.05), and greater metabolic capacity in the mitotic analysis when in contact with this material (33%). It can be concluded that the proposed chitosan-based cement containing hydroxyapatite and zinc oxide nanoparticulated with the addition of doxycycline has a bioactive effect in Schwann cells, thus promoting cell growth and mitotic activity, thus being a promising biomaterial for studies of remyelinization of peripheral nerves and nerve regeneration in vivo.

Effect of chitosan nanoparticles on microtensile bond strength of resin composite to dentin: an in vitro study / Efeito de nanopartículas de quitosana na resistência a união por microtração da resina composta à dentina: um estudo in vitro

Objective: The purpose of this study was to evaluate the effect of chitosan nanoparticles on microtensile bond strength of resin composite to dentin using self etch adhesive after aging. Material and Methods: A total number of 90 freshly extracted, sound human molar teeth. Flat tooth surface was gained after cut of the occlusal surface. Three main groups according to pretreatment of dentin before adhesive application; 0.2 % chitosan, 2.5 % chitosan and no treatment control group. Universal self etch adhesive were applied according to manufacture instruction and 4 mm of Feltik Z250 xt composite. Storage of specimens for 1 day, 3 months and 6 months in 37O C distilled water. After that, the tooth was sectioned to beams of 1 mm x8 mm sticks for microtensile bond strength test using universal testing machine. Scanning electron microscope (SEM) was used to evalute the effect of chitosan nanoparticles on dentin and smear layer. Kruskal-Wallis test was used to compare between the three groups as well as the three aging periods. Dunn's test was used for pair-wise comparisons. The significance level was set at P ≤ 0.05. Results: chitosan 0.2% is statistically significant increase in bond strength than chitosan 2.5% and control in one day group. Three months chitosan 0.2 % groups have statistically significant increase in bond strength than chitosan 2.5%. It was found in 6 months that control and chitosan 0.2 % have statistically significant increase in bond strength than chitosan 2.5%. There was statistically significant difference found between the three studied groups regarding bond strength at different storage times . Conclusion: Microtensile bond strength was influenced by different chitosan concentration. Different aging periods had no effect on the microtensile bond strength without application of chitosan and with application of 2.5% chitosan concentration. (AU)

Introdução: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das nanopartículas de quitosana na resistência da microtração de união do compósito de resina à dentina usando adesivo autocondicionante após o envelhecimento. Material e Métodos: Foram utilizados um total de 90 dentes molares humanos extraídos e sadios. A superfície plana do dente foi obtida após o corte da superfície oclusal. Os dentes foram divididos em três grupos principais de acordo com o pré-tratamento da dentina e antes da aplicação do adesivo: 0,2% de quitosana, 2,5% de quitosana e nenhum tratamento foi utilizado no grupo controle. O adesivo autocondicionante universal foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante e 4 mm de composito Feltik Z250 xt foi inserido. O armazenamento de amostras foi realizado por 1 dia, 3 meses e 6 meses em água destilada a 37 °C. Depois disso, o dente foi seccionado em peças de 1 mm x 8 mm para teste de resistência de união por microtração, utilizando máquina de teste universal. Microscópio eletrônico de varredura (MEV) foi usado para avaliar o efeito das nanopartículas de quitosana na dentina e na camada de smear layer. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar os três grupos e os três períodos de envelhecimento. O teste de Dunn foi usado para comparação pareada dos grupos. O nível de significância foi estabelecido em P ≤ 0,05. (AU)

Hidrogel de quitosana com nanofibras de Policaprolactona (PCL) associado a extratos fitoterápicos no metabolismo celular e ação antimicrobiana: estudo in vitro / Evaluation of the chitosan hydrogel with PCL nanofibers associated with phytotherapeutic extracts in cellular and microbiological activity: in vitro study

O objetivo neste estudo foi produzir hidrogel de quitosana (CH) com PCL e fitoterápicos para uso preventivo de úlcera de pressão. Os hidrogéis de CH foram produzidos com glicerofosfato (GP) e com xantana (X), associados ao PCL e foram caracterizados por estereomicroscopio, intumescimento, molhabilidade e MEV. Posteriormente foram submetidos ao teste de viabilidade (MTT) com fibroblastos HFF-1 e queratinócitos HaCat. O hidrogel que apresentou melhor resultado foi escolhido para continuar na pesquisa. Posteriormente, extratos de Pfaffia panculata K, Juglans regia L, Rosmarinus officinalis L, Zingiber officinale, Própolis e Hamamelis foram colocados em contato com cepas de Staphylococcus aureus (S.a) (ATCC 6538), Streptococcus pyogenes (S.p) (ATCC 19615), Staphylococcus epidermidis (S.e) (ATCC 12228), Pseudomonas aeruginosa (P.a) (ATCC 15442), Escherichia coli (E.c) (ATCC 25922) e Klebsiella Pneumoniae (K.p) (ATCC 4352) na forma planctônica nos testes de CIM e CMM. Os dois melhores extratos fitoterápicos foram avaliados quanto ao sinergismo no teste checkerboard e posteriormente associados ao hidrogel anteriormente eleito. A seguir, o comportamento da HaCat e HFF-1 com os hidrogéis foi analisado por MTT, proteína total, ELISA, genotoxicidade e formação de biofilme monotípico com suspensões padronizadas (107 cel/mL) de S.a, S.e, S.p, P.a, E.c e K.p. Na caracterização e viabilidade o hidrogel CHX PCL apresentou os melhores resultados. Os extratos selecionados após CIM, CMM e checkerboard foram gengibre (G) e própolis (P). O extrato G se destacou na CIM com inibição de K. p e P. a. Os extratos de G e P demonstraram ação microbicida para K. p e P. a e somente o extrato P obteve ação microbicida para S. a na CMM. Houve ação aditiva dos extratos associados no checkerboard para S.p e ação aditiva e sinérgica para S. e. Os grupos de hidrogéis foram compostos por: quitosana xantana (CHX), CHX própolis (CHXP), CHX gengibre (CHXG) e CHX própolis e gengibre associados (CHXPG), todos associados ao PCL. Todos os hidrogéis demonstraram viabilidade celular acima de 70% do grupo controle, permitindo metabolismo celular observado na proteína total. Houve quantificação de IL-6 maior no grupo CHX nas duas linhagens de células enquanto a quantificação de IL-10 não exibiu diferença estatística entre os grupos. Todos os hidrogéis promoveram redução acentuada de biofilme de K.p e E.c. Os grupos CHX, CHXP e CHXG reduziram biofilme de S.e. O grupo CHXG reduziu biofilme de S.p. Para S.a e P.a o grupo CHXPG foi mais eficaz reduzindo biofilme. Concluímos que os hidrogéis apresentaram resultados satisfatórios e promissores, trazendo inovação por associação de biopolímeros e associação de extratos fitoterápicos pouco estudados. Os resultados positivos justificam a continuidade dos estudos com esse biomaterial(AU)

The aim of this study was to produce chitosan hydrogel (CH) with PCL and herbal medicines for preventive use of pressure ulcers. The CH hydrogels were produced with glycerophosphate (GP) and xanthan (X), associated with PCL and were characterized by stereomicroscope, swelling, wettability and SEM. Subsequently, they were submitted to a viability test (MTT) with HFF-1 fibroblasts and HaCat keratinocytes. The hydrogel that presented the best result was chosen to continue the research. Subsequently, extracts of Pfaffia panculata K, Juglans regia L, Rosmarinus officinalis L, Zingiber officinale, Propolis and Hamamelis were placed in contact with strains of Staphylococcus aureus (Sa) (ATCC 6538), Streptococcus pyogenes (Sp) (ATCC 19615), epidermidis (Se) (ATCC 12228), Pseudomonas aeruginosa (Pa) (ATCC 15442), Escherichia coli (Ec) (ATCC 25922) and Klebsiella Pneumoniae (Kp) (ATCC 4352) in planktonic form in CIM and CMM tests. The two best herbal extracts were evaluated for synergism in the checkerboard test and subsequently associated with the previously elected hydrogel. Next, the behavior of HaCat and HFF-1 with hydrogels was analyzed by MTT, total protein, ELISA, genotoxicity and monotypic biofilm formation with standardized suspensions (107 cel / mL) of Sa, Se, Sp, Pa, Ec and Kp In the characterization and viability the CHX PCL hydrogel presented the best results. The extracts selected after MIC, CMM and checkerboard were ginger (G) and propolis (P). The G extract stood out in the MIC with inhibition of K. p and P. a. The extracts of G and P showed microbicidal action for K. p and P. a and only the extract P obtained microbicidal action for S. a in CMM. There was an additive action of the associated extracts on the checkerboard for S.p and an additive and synergistic action for S. e. The hydrogel groups were composed of: xanthan chitosan (CHX), CHX propolis (CHXP), CHX ginger (CHXG) and CHX propolis and ginger associated (CHXPG), all associated with PCL. All hydrogels demonstrated cell viability above 70% of the control group, allowing cellular metabolism observed in the total protein. There was a greater quantification of IL-6 in the CHX group in the two cell lines while the quantification of IL-10 did not show statistical difference between the groups. All hydrogels promoted a marked reduction in the biofilm of K.p and E.c. The CHX, CHXP and CHXG groups reduced S.e biofilm. The CHXG group reduced S.p. For S.a and P.a, the CHXPG group was more effective in reducing biofilm. We conclude that the hydrogels presented satisfactory and promising results, bringing innovation through association of biopolymers and association of phytotherapic extracts little studied. The positive results justify the continuity of studies with this biomaterial(AU)

Behaviour of diferent types of chitosan membranes implanted in horses / Comportamento de diferentes tipos de membranas de quitosana implantadas em equinos

Chitosan has been successfully used as a biomaterial with several purposes in many species. In this study, chitosan membranes were produced with six different types of materials, and their behavior were evaluated upon implantation in the subcutaneous tissue of the flank of twelve healthy horses. We assessed chitosan membranes obtained from commercial chitosan, impregnated or not with silver nanoparticles, sterilized with ethylene oxide (CCEO, n=3; CCSNEO, n=3) or by ultraviolet radiation (CCUR, n=3; CCSNUR, n=3), and chitosan membranes obtained from squid gladius, sterilized with ethylene oxide (SCEO, n=6) or by ultraviolet radiation (SCUR, n=6). The same animals were randomly used in two experimental groups, with a minimum interval of 60 days between procedures, respecting the fact of only one flank side, left or right, be under evaluation by experimental period. After preparation of the membranes and implantation in the flank subcutaneous tissue of the horses, macroscopic and ultrasonographic evaluations of the implant regions were performed, as well as physical examination, blood count and fibrinogen measurement. No clinical or laboratory abnormalities were observed. All animals that received commercial chitosan membranes, regardless of the preparation technique, showed rejection to the biomaterials, considering that 100% of the surgical wounds presented dehiscence of suture and expulsion of the implants. The animals that received squid gladius chitosan membranes showed success in the treatment, with healing by primary intention of the surgical wound. We conclude that squid gladius chitosan membranes are biocompatible and biodegradable when implanted in the subcutaneous tissue of the flank of healthy horses.(AU)

A quitosana tem sido utilizada, com sucesso, como biomaterial para diversas espécies e finalidades. Neste estudo foi avaliada a confecção de membranas de quitosana, produzidas a partir de seis tipos de materiais diferentes e foi estudado seu comportamento quando implantadas no tecido subcutâneo do flanco de doze equinos sadios. Foram avaliadas membranas de quitosana obtidas de quitosana comercial, impregnadas ou não com nanopartículas de prata, esterilizadas com óxido de etileno (QCOE, n=3; QCNPOE, n=3) ou por radiação ultravioleta (QCRU, n=3; QCNPRU, n=3) e membranas de quitosana obtidas do gládio de lula, esterilizadas com óxido de etileno (GLOE, n=6) ou por radiação ultravioleta (GLRU, n=6). Os mesmos animais foram utilizados em dois grupos experimentais, de forma aleatória, com um intervalo mínimo de sessenta dias entre os procedimentos, respeitando-se o fato de apenas um lado do flanco, esquerdo ou direito, estar em avaliação por período experimental. Após preparo das membranas e implantação no tecido subcutâneo do flanco dos equinos, foram realizadas avaliações macroscópicas e ultrassonográficas das regiões de implante, além de exames físicos, hemogramas e fibrinogênio. Não foram observadas alterações clínicas e laboratoriais. Todos os animais que receberam membranas de quitosana comercial, independente da técnica de preparo, demonstraram rejeição dos biomateriais, uma vez que 100% das feridas cirúrgicas apresentaram deiscência da sutura e expulsão dos implantes. Os animais que receberam as membranas de quitosana de gladio de lula demonstraram sucesso no tratamento, com cicatrização das feridas cirúrgicas por primeira intenção. Conclui-se que membranas de quitosana de gládio de lula são biocompatíveis e biodegradáveis, quando implantadas no tecido subcutâneo do flanco de equinos sadios.(AU)

Desenvolvimento de biomateriais à base de quitosana: matriz de fibras eletrofiadas para regeneração tecidual e de hidrogel coacervado para entrega controlada de fármaco / Development of chitosan-based biomaterials: electrospun fiber matrix for tissue regeneration and coacervate hydrogel for controlled drug delivery

Os atuais avanços no desenvolvimento de biomateriais caminham para 2 áreas promissoras: a de regeneração tecidual e a de entrega controlada de fármacos. Assim, o presente estudo objetivou a síntese e caracterização de diferentes matrizes (fibras e hidrogel) à base de quitosana, a fim de se obter materiais biomiméticos para atuação em ambas áreas. Para regeneração, delineou-se a síntese de um arcabouço de fibras de quitosana com e sem cristais de nanohidroxiapatita onde, para isso, foram eletrofiadas soluções de quitosana (Ch) e de quitosana com nanohidroxiapatita (ChHa). Os espécimes de Ch apresentaram maior homogeneidade e maior diâmetro médio de fibras (690 ± 102 nm) que ChHa (358 ± 49 nm). No teste de viabilidade celular e na atividade da fosfatase alcalina não houve diferença estatística entre os grupos experimentais (Ch e ChHa), porém ambos diferiram do grupo controle (p < 0,001). Para o âmbito de liberação de fármacos, sintetizou-se, pela técnica de emulsão, dois tipos de hidrogéis: o primeiro, uma mistura da fase aquosa da solução de Ch (1 mL) e da solução de DNA (1 mL) (1:1) e o segundo, mistura da fase aquosa da solução de Ch (1 mL) e solução de Pectina (1 mL) (1:1). Ambas misturas foram realizadas em álcool benzílico (5 mL) com instrumento de dispersão de alto desempenho (31-34000 rpm min-1 por 5 min). Após a obtenção dos géis, 20mg de cada grupo foram imersos em uma solução aquosa de Própolis Verde (PV), na concentração de 70 µg/mL por 2 h e a cinética de liberação do PV foi analisada a 25 e 37oC em água e saliva artificial. Os espécimes obtidos foram liofilizados e depois caracterizados físicoquimicamente. A presença de pectina e de DNA foi comprovada por FTIR. A sorção de PV induziu uma modificação significativa da superfície do gel. Constatou-se uma separação de fases entre a quitosana e o DNA. A eficiência do encapsulamento não mudou significativamente entre 25 e 37oC. A cinética de liberação na água ou na saliva apresentou um mecanismo de duas etapas. E os resultados biológicos exibiram que esses materiais são aceitáveis no ambiente biológico. Assim, conclui-se que a matriz de fibras de quitosana com nHAp é capaz de promover diferenciação celular e a matriz de hidrogel de quitosana com Pectina ou DNA possui potencial para a liberação controlada de fármacos(AU)

Current advances in biomaterial development are moving to 2 promising areas: tissue regeneration and controlled drug delivery. Thus, the present study aimed the synthesis and characterization of different matrices (fibers and hydrogel) based on chitosan, in order to obtain biomimetic materials for performance in both areas. For regeneration, the synthesis of a scaffold of chitosan fibers with and without nanohydroxyapatite crystals was delineated, where chitosan (Ch) and chitosan with hydroxyapatite (ChHa) solutions were electrospun. Ch specimens presented higher homogeneity and larger mean fiber diameter (690±102nm) than ChHa (358 ± 49nm). In the cell viability test and alkaline phosphatase activity there was no statistical difference between the experimental groups. (Ch and ChHa), but both differed from the control group (p < 0,001). For the drug release scope, two types of hydrogels were synthesized by the emulsion technique: the first, a mixture of the aqueous phase of Ch solution (1 mL) and DNA solution (1 mL) (1:1) and the second, mixture of the aqueous phase of the Ch solution (1mL) and Pectin solution (1 mL) (1:1). Both mixtures were performed in benzyl alcohol (5 mL) with high performance dispersion instrument (31-34000 rpm min-1 for 5 min). After obtaining the gels, 20mg from each group were immersed in an aqueous solution of Propolis Green (PV), at a concentration of 70 µg/mL for 2 h and the release kinetics of PV were analyzed at 25 and 37oC in water and artificial saliva. The obtained specimens were lyophilized and then physically-chemically characterized. The presence of pectin and DNA was confirmed by FTIR. PV sorption induced a significant modification of the gel surface. A phase separation was found between chitosan and DNA. Encapsulation efficiency did not change significantly between 25 and 37oC. The release kinetics in water or saliva presented a two-step mechanism. And the biological results showed that these materials are acceptable in the biological environment. Thus, it is concluded that the nHAp chitosan fiber matrix is capable of promoting cell differentiation, whereas the chitosan hydrogel matrix with Pectin or DNA are potential biomaterials for controlled drug release(AU)

Recovery of chitin and chitosan from shrimp waste with microwave technique and versatile application / Recuperação de quitina e quitosana de resíduos de camarão por micro-ondas e aplicação versátil

In this study, chitin and chitosan were extracted from Litopenaeus vannamei waste using chemical and microwave methods. Shrimp waste was cleaned, dried and ground sieved to 16, 32 and 60 mesh, and the samples were depigmented, demineralized, and deproteinized. Then, the chitin was submitted to a deacetylation process by 45% NaOH solution under microwave irradiation at 600w, for intermittent 15 min or using 5 pulses of 5 minutes. The study showed that the effectiveness of the particle size of 32 mesh and 6 pulses of 5 min to deacetylation with 92% of degree and chitosan yield (52.2%). The polymer chitosan showed higher antimicrobial activity against to Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica and the yeast Candida sp., respectively. The results indicated the feasibility of the microwave radiation as an attractive method to recover chitin and chitosan from shrimp wastes.(AU)

Neste estudo, a quitina e a quitosana foram extraídas de resíduos de Litopenaeus vannamei utilizando métodos químicos e do micro-ondas. Os resíduos de camarão foram limpos, secos e peneirados a 16, 32 e 60 mesh, e as amostras foram despigmentadas, desmineralizadas e desproteinizadas. Posteriormente, a quitina foi submetida a processo de desacetilação por solução de NaOH a 45% sob irradiação de micro-ondas a 600w, durante 15 min intermitentes ou utilizando 6 pulsos de 5 min. O estudo mostrou eficácia nas partículas com tamanho de 32 mesh e 6 pulsos de 5 minutos, com 92% grau de desacetilação e rendimento de quitosana (52,2%). A atividade antimicrobiana foi para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Salmonella enterica contra a levedura Candida sp., respectivamente. Os resultados indicaram a viabilidade da radiação de micro-ondas como um método atraente para recuperação de quitina e quitosana a partir de resíduos de camarão.(AU)

Efeito do laser de baixa intensidade na atividade biológica de células-tronco do ligamento periodontal humano cultivadas sobre arcabouços de quitosana / Effect of low-intensity laser on the biological activity of human periodontal ligament stem cells cultured on chitosan scaffolds

O laser de baixa intensidade (LBI) é capaz de estimular a proliferação de diferentes tipos celulares, porém pouco se sabe sobre sua eficácia na proliferação de células cultivadas na superfície dos biomateriais. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do LBI na proliferação e viabilidade de células-tronco do ligamento periodontal humano (PDLSCs) cultivadas em arcabouços de quitosana. A quitosana foi submetida a testes para identificação do teor real de massa e grau de desacetilação. Membranas de quitosana foram preparadas pela técnica de evaporação de solvente e submetidas a caracterização de morfologia e de superfície. PDLSCs previamente isoladas e caracterizadas foram cultivadas sobre quatro superfícies: (P) plástico da placa de cultivo, não irradiado, como controle positivo de crescimento celular; (Q) quitosana, não irradiado; (L1) quitosana, irradiado com dose de 1 J/cm²; e (L4) quitosana, irradiado com 4 J/cm². As irradiações foram realizadas com laser diodo InGaAlP, com comprimento de onda de 660 nm, potência de 30 Mw, diâmetro da ponta de 0.01cm² e modo de ação contínuo, em dose única. Os dados mostraram que a quitosana apresentou um teor real de massa de 88,08% e grau de desacetilação de 91,37±3,77%. A análise das membranas por MEV mostrou superfície uniforme e homogênea, com espessura média de 68,71 µm. A análise por microscopia de força atômica revelou uma rugosidade média de 285 nm. O peso das membranas variou de 0,03 a 0,04 g, indicando a sua uniformidade, e o pH de superfície exibiu média de 6,9±0,25, valor próximo ao pH da saliva. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas através dos ensaios de Alamar Blue, Live/Dead, Annexin V/PI e Ki67, além da análise do ciclo celular, e a morfologia celular foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O ensaio do Alamar Blue mostrou diferenças significativas na atividade mitocondrial entre os grupos nos intervalos de 24 h (L1>Q, p= 0,0118) e em 48 h (L1>Q, p= 0,0022; L4>Q, p=0,0002; L4>L1, p= 0,0022). O ensaio Live/Dead mostrou maior densidade de células vivas nos grupos irradiados (L1 e L4) em relação ao grupo sem irradiação (Q), o que foi comprovado pelo ensaio da Annexin V/PI, que mostrou um maior percentual de células viáveis em L4 (89,5%) e L1 (87,0%) em comparação com Q (78,4%) em 72 h. A imunoexpressão da proteína Ki67 foi maior em L4 e L1 e estes dois grupos apresentaram também um maior percentual de células nas fases proliferativas do ciclo celular (S e G2/M). A análise por MEV mostrou no grupo Q células com morfologia mais arredondada e com poucas projeções, além de debris celulares, enquanto nos grupos irradiados as células exibiram um arranjo mais plano, com projeções mais distribuídas e pontos de adesão focal, especialmente em L4. Em conjunto, os resultados do presente trabalho permitem concluir que a laserterapia nos padrões estudados, especialmente na dose de 4 J/cm², influencia positivamente a viabilidade e a proliferação de PDLSCs em membranas de quitosana, permitindo assim que as células superem eventuais efeitos adversos do microambiente do arcabouço (AU).

Low-level laser irradiation (LLLI) is able to stimulate the proliferation of various cell types, but little is known about its effectiveness on the proliferation of cells cultured on biomaterial surfaces. The aim of this study was to evaluate the influence of LLLI on the proliferation and viability of human periodontal ligament stem cells (PDLSCs) cultured on chitosan scaffolds. Chitosan was submitted to tests to identify the real mass content and degree of deacetylation. Chitosan membranes were prepared by solvent evaporation technique and submitted to morphology and surface characterization. PDLSCs previously isolated and characterized were grown on the surfaces of four groups: (P) culture plate plastic, non-irradiated, as a positive control of cell growth; (C) chitosan, non-irradiated; (L1) chitosan irradiated with a dose of 1 J/cm²; and (L4) chitosan, irradiated with 4 J/cm². The irradiations were performed with InGaAlP diode laser with wavelength of 660 nm, power 30 mW, tip diameter of 0.01cm², and continuous action mode in a single dose. Cell viability and proliferation were evaluated by Alamar Blue, Live/Dead, Annexin V/PI and Ki67 assays, as well as cell cycle analysis, whereas cell morphology was evaluated by MEV. The data showed that the chitosan presented a real mass content of 88.08% and degree of deacetylation of 91.37 ± 3.77%. SEM analysis showed membranes with uniform and homogeneous surface, with a mean thickness of 68.71 µm. Analysis by AFM revealed roughness around 285 nm. The weight of the membranes ranged from 0.03 to 0.04 g, indicating their uniformity, and the surface pH exhibited a mean of 6.9 ± 0.25, a value close to the pH of the saliva. The Alamar Blue assay showed significant differences in mitochondrial activity between groups at 24 h (L1> C, p = 0.0118) and at 48 h (L1> C, p = 0.0022; L4> C, p = 0.0002; L4>L1, p = 0.0022). The Live/Dead assay showed higher density of live cells in irradiated groups (L1 and L4) compared to the group without irradiation (C), which was confirmed by assay of Annexin V/PI, which showed a greater percentage of viable cells in L4 (89.5%) and L1 (87.0%) compared to C (78.4%) at 72 h. The Ki67 immunoexpression was higher in L4 and L1 and these two groups also showed a higher percentage of cells in the proliferative phases of the cell cycle (S and G2/M). The SEM analysis showed in group C cells with more rounded morphology and with few projections, as well as cell debris, whereas in the irradiated groups the cells exhibited a more flat arrangement, more distributed projections and focal adhesion points, especially in L4. Taken together, the results of the present study shown that laser therapy in the studied patterns, especially at the dose of 4 J/cm², has a positive effect on viability and proliferation of PDLSCs on chitosan membranes, thereby allowing the cells to overcome any adverse effects of the scaffold microenvironment (AU).

Otimização e padronização de processos para obtenção de quitosana purificada para uso farmacêutico e alimentício / Optimization and standardization of processes to obtain purified chitosan for pharmaceutical and food use

Quitosana é um biopolímero encontrado principalmente na parede celular de crustáceos e é obtida pela desacetilação da quitina. Como biopolímero a quitosana é utilizada como excipiente para medicamentos e composição de alimentos. No entanto a quitosana devidamente purificada para uso farmacêutico ou alimentício tem custo financeiro elevado. Outro fator que contribui para o uso limitado é a falta de procedimento padronizado para desacetilação, o que resulta em materiais com diferentes graus de qualidade, dificultando suas aplicações e controle de qualidade de matéria prima e produto. Este trabalho tem como principal objetivo estabelecer procedimento reprodutível para a extração da quitina e da quitosana, por meio da aplicação dos conceitos de Quality by Design e planejamento de experimentos. A quitosana foi obtida pela desacetilação da quitina de crustáceos pelas etapas de desmineralização, desproteinização e despigmentação. O procedimento técnico para purificação da quitosana foi definido a partir de planejamento fatorial com ponto central para as etapas otimizadas, por meio da aplicação dos conceitos de Quality by Design e planejamento de experimentos. O projeto definiu um procedimento padronizado para purificação da quitosana que pode ser empregado em escala industrial, e financeiramente vantajoso para produção de medicamentos ou alimentos

Chitosan is a biopolymer found mainly in the cell wall of crustaceans and is obtained by the deacetylation of chitin. As biopolymer chitosan is used as excipient for medicaments and food composition. However, chitosan duly purified for pharmaceutical or food use has a high financial cost. Another factor that contributes to the limited use is the lack of standardized procedure for deacetylation, which results in materials with different grades of quality, hindering their applications and quality control of raw material and product. This work has as main objective to establish a reproducible procedure for the extraction of chitin and chitosan, through the application of the concepts of Quality by Design and planning of experiments. Chitosan was obtained by the deacetylation of chitin from crustaceans through the demineralization, deproteinization and depigmentation stages. The technical procedure for purification of chitosan was defined from a factorial planning with a central point for the optimized steps, through the application of the concepts of Quality by Design and planning of experiments. The project defined a standard procedure for the purification of chitosan that can be used on industrial scale and financially advantageous for the production of medicines or foods